Реферат: полимеразная цепная реакция

5. Организация технологического процесса постановки ПЦР

Потенциально высокая чувствительность полимеразной цепной реакции делает совершенно необходимым особенно тщательное устройство ПЦР-лаборатории. Это связано с наиболее острой проблемой метода — контаминацией.

Контаминация — попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные результаты.

Существует несколько способов борьбы с этим неприятным явлением. Одним из них является использование фермента N-урацил-гликозилазы (УГ). В основе этого метода лежит способность УГ расщеплять молекулы ДНК со встроенным урацилом. Реакцию амплификации проводят с использованием смеси дНТФ, в которой дТТФ заменен на урацил, и после термоциклирования все образующиеся в пробирке ампликоны будут содержать урацил. Если до амплификации в реакционную смесь добавить УГ, то попавшие в реакционную смесь ампликоны будут разрушены, тогда как нативная ДНК останется целой и будет в дальнейшем служить мишенью для амплификации.

Таким образом, этот метод лишь в некоторой степени позволяет устранить источник контаминации и не гарантирует от ложноположительных результатов.

Другой способ борьбы с результатами контаминации, значительное уменьшение количества циклов реакции (до 25-30 циклов). Но даже при таком подходе риск получения ложноположительных результатов велик, т.к и в этом случае при отсутствии ингибиторов легко получить продукт амплификации из-за контаминации.

Таким образом, несмотря на пользу преамплификационных мероприятий, направленных на инактивацию молекул ДНК, служащих причиной возникновения ложноположительных результатов, наиболее радикальным средством является заранее продуманная организация лаборатории.

Основные принципы

Итак, ПЦР — это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают «праймеры» (затравки) — синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК — двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:

1. денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) — 95°С — 1 или 2 минуты;
2. отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) — 60°С (к примеру) — 1 минута;
3. элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) — 72°С — 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).

Мазки из половых путей и уретры – самый распространённый анализ на ИППП у женщин

Этот анализ на ИППП, который сдают все женщины на приеме у гинеколога. Врач берет мазки с поверхности шейки матки, заднего свода влагалища и уретры. Все три образца наносятся на предметное стекло и помечаются:

• С – цервикальный канал.
• U – уретра (мочеиспускательный канал).
• V – задний свод влагалища.

В лаборатории проводится бактериоскопическое исследование мазков под микроскопом. Выявляются возбудители ИППП, определяется количество здоровой и патогенной микрофлоры, определяется количество лейкоцитов и эпителия – ткани, покрывающей слизистую женских половых путей.

Поэтому исследование позволяет не только выявить венерические инфекции, но и обнаружить другие заболевания. Однако метод имеет и недостатки:

• Достаточно невысокую точность, не превышающую 90%. Метод плохо выявляет ИППП на ранней стадии, когда концентрация возбудителей невелика.
• Невозможность выявления вирусных инфекций.

Недостаточная выявляемость заболеваний, протекающих в скрытой (латентной) форме. При подозрении на скрытое заражение ИППП анализ нужно сдавать сразу после окончания критических дней – в это время микроорганизмы легче обнаружить. Второй способ “вывести возбудителей из тени” – мазок с провокацией. Женщине вводят препарат, вызывающий обострение инфекции, а потом берут мазки.

Из-за своих недостатков этот метод диагностики постепенно теряет позиции, уступая место более современным исследованиям.

Такой анализ довольно легко расшифровать:

• Лейкоцитов в уретре и влагалище должно быть не более 10, на шейки матки – менее 30.
• Количество клеток плоского эпителия не может превышать 15.
• Должны обнаруживаться палочки Додрелейна – здоровая микрофлора, защищающая половые пути от вредоносных микроорганизмов.
• Не должны присутствовать возбудители венерических заболеваний.
• Возможно присутствие небольшого количества слизи.

Отклонения от нормы указывают на половые инфекции или воспалительные процессы. Пациентке нужно обследоваться и лечиться.

Чтобы понять суть Real-time PCR, необходимо имеет представление о том, какие процессы проходят в пробирке во время «обычной» ПЦР.

ПЦР представляет собой реакцию амплификации молекул ДНК. Рассмотрим два случая, когда в исследовательской практике возникает необходимость амплифицировать (то есть увеличить во много раз) количество ДНК в образце

Например, для судмедэксперта важно размножить небольшое количество ДНК, которая была найдена на месте преступления. Либо исследователю нужно сравнить два образца и узнать, в каком из них больше ДНК

Для такого рода анализа необходимо, чтобы в образце было достаточно ДНК для ее детекции. Если ДНК слишком мало, в сравниваемых образцах проводят ПЦР при одних и тех же условиях, и по количеству амплифицированного продукта определяется, в каком из образцов было больше ДНК изначально.

Главным веществом, благодаря которому происходит ПЦР, является термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Этот фермент синтезирует цепочку ДНК из свободных нуклеотидов, содержащихся в реакционной смеси (dNTPs), по принципу комплементарности. Матрицами для создания новых цепочек являются исследуемые молекулы ДНК. Важный момент – ДНК-полимераза «работает» на одноцепочечной ДНК, при этом «точка старта» для нее может быть только на двухцепочечной ДНК.

Именно эта особенность данного фермента позволяет амплифицировать только те фрагменты ДНК, которые интересны исследователю, а не весь геном организма сразу. Для этого в реакционную смесь добавляют небольшие фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), называемые праймерами (англ. primer, то есть «первичные»). Они присоединяются (отжигаются) на матричную молекулу ДНК вокруг исследуемого гена, запуская работу полимеразы в нужном направлении.

Контроль ПЦР обеспечивается благодаря смене температуры образцов – за счет этого обеспечивается регуляция активности фермента и присоединения праймеров.

Для того, чтобы начать реакцию, температуру повышают до 95°C. При такой температуре двухцепочечная ДНК денатурирует до одноцепочечной.

Потом температуру понижают до ~60°C. Это позволяет праймерам присоединиться вокруг исследуемого фрагмента.

Таким образом, у полимеразы появляется точка старта, от которой она может начинать синтез новой цепочки ДНК:

Оптимальная температура для работы ДНК-полимеразы составляет 72°C, поэтому на этом этапе цикла (он называется элонгацией) температура образца повышается до 72°C, для того, чтобы фермент работал с максимальной скоростью.

По окончанию цикла мы получаем в 2 раза больше ДНК, чем было в начале.

Такие температурные изменения повторяются по кругу в течение 40 «циклов». То есть, из одной копии ДНК получаются две, из двух – четыре, из четырех – восемь и так далее, пока их количество не будет исчисляться миллиардами.

После амплификации полученную ДНК можно разделить на агарозном геле и окрасить (визуализировать). Чем ярче будет полоса на геле, тем большее количество копий нужных нам генов получилось в результате реакции.

Анализ методом ПЦР

ПЦР анализ — что это такое? Это метод использует принципы молекулярной биологии. Для исследования материала применяются особые ферменты, которые многократно и быстро копируют ДНК, РНК фрагменты возбудителей болезни. Существует разные виды ПЦР анализа в зависимости от исследуемого материала (кровь, моча, кал и т.д.). После обработки сотрудники лаборатории сравнивают с базой данных полученный результат, выявляют концентрацию, тип возбудителя.

Анализ на ПЦР помещают в специальный амплификатор (прибор), который нагревает и охлаждает пробирки с биоматериалом. Изменения температуры нужны для репликации фрагментов. Точность результата будет зависеть от точности температурного режима. Метод полимеразной цепной реакции помогает выявить:

• инфекционный мононуклеоз;
• ВИЧ;
• цитомегаловирусную инфекцию;
• вирусные гепатиты G, C, B, A;
• инфекции/заболевания, передающиеся половым путем (ИППП/ЗППП): гарднереллез, трихомониаз, уреаплазмоз;
• герпетическую инфекцию;
• онкогенные вирусы;
• листериоз;
• хеликобактерную инфекцию;
• клещевой энцефалит, боррелиоз;
• туберкулез;
• кандидоз.

Крови

На данный момент из-за новизны технологии анализ крови методом ПЦР все еще имеет высокую цену. Для подготовки биоматериала не нужно соблюдать определенные требования. Даже вызванные физическими нагрузками, стрессами, сменой рациона питания изменения состава не влияют на результат исследования. ПЦР анализ крови может испортить только прием антибактериальных средств, поэтому перед сдачей необходимо выдержать паузу между лечением и тестом.

ПЦР исследование крови – самый распространенный вариант диагностики хронических, острых инфекционных патологий при вирусном или атипичном проявлении. Серологические методы исследования имеют определенную трудность при проведении – определение наличия возбудителя проводится по наличию антител в организме человека. Результат мог быть ложноотрицательным, если состояние больного не давало время для их выработки.

Мазка

В сфере гинекологии для исследования наличия инфекционных микроорганизмов используют ПЦР анализ мазка. Работа с материалом проводится по тому же принципу, что и с кровью: многократное увеличение фрагментов ДНК возбудителя, чтобы с легкостью его идентифицировать. Это же помогает обнаружить скрытые инфекции у женщины. Для проведения анализа могут быть взяты разные биологические жидкости: слюна, мокрота, моча, кровь. В гинекологии для точности определения чаще используется мазок со слизистой влагалища из цервикального канала.

Для проведения ПЦР существуют определенные показания. Нередко его нужно сделать, чтобы выявить устойчивый к антибиотикам вид возбудителя. У женщин основными показаниями для диагностики по этому методу выступают:

• беременность, которая протекает тяжело;
• острая фаза ИППП;
• если есть подозрение на переход ИППП в хроническую стадию;
• поиск причин бесплодия.

Кала­

Для выявления инфекции может быть назначен со стороны врача анализ кала на ПЦР. Для того, чтобы получить максимально достоверные результаты после теста, необходимо придерживаться следующих правил перед забором биоматериала:

• за несколько суток прекратить прием слабительных препаратов: масла, свечи;
• исключить медикаменты, которые дают специфическую окраску калу, к примеру, с содержанием железа.

Для забора следует использовать стерильную палочку и контейнер. Чем-либо их дополнительно протирать, ополаскивать не нужно. При сборе материала будьте осторожны, вы не должны задеть рукой внутренние стенки контейнера. Следите, чтобы в кале не было примесей мочи, нельзя использовать дополнительные вспомогательные средства для испражнения (клизма). Собирать материал нужно в день сдачи, хватит 1/3 объема контейнера. Данный метод диагностики имеет следующие преимущества:

1. Анализ способен указывать на ДНК паразита, другие же тесты могут определять только остатки их жизнедеятельности.
2. Высокая точность, будет установлен возбудитель.
3. Ультрачувствительный анализ, который способен выявить даже одну клетку вируса.
4. Результат исследования ПЦР будет готов через 4-5 часов.

Мочи

При необходимости для проведения теста врач может взять для исследования мочу. Высокая точность открывает возможность работать с любой биологической жидкостью, из которой удается извлечь ДНК вируса. Чтобы сдать анализ мочи ПЦР, нужно придерживаться таких ограничений перед забором материала:

• минимум за 1 день до процедуры прекратить половые контакты;
• за 3 недели до сдачи должно быть окончено любое антибактериальное лечение, потому что медикаменты смажут картину;
• сдавать анализ нужно натощак (жидкость тоже запрещена);
• брать нужно первую утреннюю порцию материала.

Средняя стоимость

Цены на проведение полимеразной цепной реакции определяют: вид исследования, сложность идентификации возбудителя, трудность забора биологического материала, вид анализа (качественный или количественный), уровень цен в лаборатории.

Ориентировочно, стоимость анализа ПЦР в рублях:

• гонококк, гарднерелла, трихомонада вагиналис – от 180
• хламидия трахоматис – от 190
• папилломавирус – от 380 до 500
• биоценоз урогенитального тракта у женщин (количественная и качественная оценка микрофлоры) – от 800.

3.3 Оценка результатов реакции

Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов

Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что в жизни встречается не часто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.

Как и когда пациенты узнают о результатах?

В среднем на получение ответа при исследовании по методу ПЦР отводится от нескольких часов до двух дней. При любом результате пациента извещает медицинское учреждение, направившее его на анализ.

В случае положительного ответа принимается решение о помещении его на домашний карантин или на лечение в стационар в зависимости от тяжести протекания заболевания. Обязательно устанавливается круг лиц, с кем в ближайшее время заболевший контактировал. У них производится забор материала для проведения теста на коронавирус.

В случае отрицательного результата рекомендуется повторить тест через 4 дня от первого забора материала на анализ. Не исключается вероятность, что заражение произошло, но диагностика проведена слишком рано.

Российские тест-системы по методу ПЦР

Отечественные лаборатории активно включились в процесс разработки тестов на определение коронавирусной инфекции.

Название теста	Особенности	Время результата	Планируемое количество к выпуску
Вектор	Набор не включает в себя реагенты для проведения исследования. Материал доставляется в лабораторию, где производят анализ. Эксперты отмечают невысокую чувствительность тестов.	До двух дней	Уже выпущено 2 млн.
НПФ Литех	Тесты на выявление Covid-19 по методу ПЦР.	До двух дней	10000 тестов в сутки, с возможностью расширения до 50 тысяч
Поливир SARS-CoV-2	Предлагается два варианта тестов: Base – с комплектом реагентов для проведения анализа; Express – с дополнительными реагентами, позволяющими ускорить процесс определения результата.	До 3 часов. Экспресс-метод до двух часов.	Планируется выпускать в неделю 100-200 тест-систем.
Изотерм SARS-CoV-2 РНК-скрин	Применяется метод петлевой изотермальной амплификации. Этот метод может выявлять наличие вируса к любой биологической жидкости, взятой у пациента, имеет меньшую вероятность ошибок и сокращает время получения результата.	В пределах 1 часа	Планируется выпуск в неделю до 500 тысяч тестов.
Смартлайфкеа	Применяется метод петлевой изотермальной амплификации. Отмечается высокая точность тестов.	До 30 минут	Планируется еженедельный выпуск примерно 2,5 млн. тестов, а также до 1 млн. портативных лабораторий
Экспресс-тесты Медико-биологического союза	Высокая чувствительность к выявлению Covid-19	До 40 минут	Не уточняется
Тесты ДНК-Технология	Позволяет определить в пробирке с материалом, взятым у пациента, до 10 копий коронавируса	Не уточняется	В неделю до 400 тыс.тестов. Возможно расширение мощностей до 1 млн. тестов в неделю
Тесты DRD Biotech	Используется метод распознавания наличия антител в биологическом материале пациента. Используется в дополнение к ПЦР-диагностике	Моментально по капле крови человека. Можно использовать даже дома	В стадии разработки

Узнать подробнее, где сдать тест на коронавирус и антитела к нему, а также о его стоимости, можете ознакомиться на этой странице.

Противопоказания для проведения

Процедура ПЦР применяется в клинике инфекционных болезней, неонатологии, акушерстве, педиатрии, урологии, гинекологии, венерологии, неврологии, нефрологии, офтальмологии.

Показания для назначения анализа:

• выяснение риска развития генетических отклонений у ребенка при вероятности наследственных патологий;
• диагностирование обоих родителей при планировании беременности или тяжелом состоянии матери при протекающей беременности;
• трудности с зачатием, выявление причин бесплодия;
• подозрение на половые инфекции в острой стадии и при симптоматике перехода их в хроническую;
• обнаружение причин воспалительных процессов неясного происхождения;
• незащищенные случайные и постоянные половые контакты;
• определение чувствительности патогенного микроорганизма к конкретным антибиотикам;
• пациентам с подозрением на скрытую инфекцию для обнаружения патогенов до развития явной симптоматики (доклиническое диагностирование);
• больным для подтверждения выздоровления после болезни (ретроспективная диагностика);:

Также используется диагностика при необходимости точного выявления следующих возбудителей::

• вирусы гепатита (A B C G), иммунодефицита человека, цитомегаловирус;
• вибрион холерный;
• вирус простого герпеса, герпетиформные виды;
• ретро – адено – и риновирусы;
• вирусы краснухи, Эпштейна-Барр, варицелла (Зостер – вирус);
• парво – и пикорновирусы;
• вирус папилломы;
• онкогенные вирусы;
• бактерия Helicobacter pylori;
• легионеллы, патогенные типы палочки кишечной;
• стафилококк золотистый;
• возбудитель менингита;
• клостридии, дифтерийная и гемофильная палочка;

Используется и для определения инфекций:

• инфекционный мононуклеоз;
• боррелиоз, листериоз, клещевой энцефалит;
• кандидоз, вызываемый грибками Candida;
• половые инфекции – трихомониаз, уреаплазмоз, бледная трепонема, гарднереллез, гонорея, микоплазмоз, хламидиоз;
• туберкулез.

Однако забор биоматериала из шеечного канала матки не проводят после процедуры кольпоскопии. Сдача мазков, соскобов на анализ разрешена только через 4 – 6 дней после окончания менструации и полного прекращения выделений.

Общие сведения при исследовании мочи для мужчин и женщин

Следует сдать на анализ первую мочу утром, ее среднюю порцию. Другими словами начинать мочиться следует в унитаз. Затем остановить акт мочеиспускания, подставить под уретру баночку для сбора мочи, продолжить мочиться в течении 2-3 секунд, затем снова остановить мочеиспускание и, убрав контейнер, закончить акт мочеиспускания в унитаз.

Женщинам и мужчинам перед тем как сдать ПЦР следует хорошо вымыть наружные половые органы для исключения попадания в мочу смегмы (смесь секрета сальных желез крайней плоти) и выделений из влагалища.

Баночка для мочи должна быть стерильной. Попросите контейнер в клинике, где вы сдаете анализ, либо заранее приготовьте баночку с плотно закрывающейся крышкой и прокипятите их не менее 10 минут.

Непосредственно перед сдачей ПЦР запрещено:

• мочиться (необходима самая первая порция мочи за день);
• изменять количество выпитой за сутки до исследования жидкости. Это необходимо, чтобы поддерживать обычный водно-электролитный баланс организма, в котором себя комфортно чувствует потенциальный возбудитель инфекции;
• использовать уросептики;
• применять мыло, содержащее в себе антибиотик;
• заниматься сексом за 12 часов до исследования;
• при менструации желателен забор мочи уретральным катетером для исключения попадания крови в контейнер с мочой;

Если один из пунктов был нарушен:

Следует воздержаться от проведения диагностики инфекций методом ПЦР. Если же все-таки анализ был сдан, следует его повторить через двое суток. Если при использовании антисептиков и антибиотиков результат оказался «хорошим» – не стоит радоваться. Скорее всего, при наличии определенных жалоб, это ложноположительный результат.

Лабораторные исследования

Для правильной постановки диагноза женщина сдает анализы, позволяющие уточнить характер патологии и провести дифференциальную диагностику с другими болезнями, дающими похожие симптомы. Лабораторный метод выявляет причины гинекологических заболеваний и их осложнения. Чаще всего пациенткам назначаются:

• ПЦР-диагностика, обнаруживающая различные половые инфекции, в том числе протекающие скрыто.  Более функциональный вариант такого исследования – Фемофлор, выявляющий наличие разнообразной патологической флоры.
• Общий анализ крови и мочи, по которым можно определить болезни почек, часто сопровождающие гинекологические патологии, анемию (малокровие), вызванные кровотечениями, воспалительные процессы.
• Анализ крови на сахар. Сахарный диабет провоцирует молочницу и другие воспалительные процессы слизистой половых органов.
• Биохимическое исследование крови, позволяющее выявить заболевания внутренних органов, повлиявшие на репродуктивную систему.
• Анализ крови на гормоны. Это исследование помогает обнаружить заболевания, вызванные различными гормональными сбоями и неправильной работой желез, вырабатывающих гормональные вещества.
• Иммунологические исследования, назначаемые при подозрении на иммунные причины гинекологических болезней. Такая диагностика выявляет заболевания, при которых иммунитет по каким-то причинам начинает атаковать репродуктивную систему женщины.

Общий анализ крови

Общий анализ мочи

Кровь на гормоны

Иммунологические исследования

Кроме гистероскопии, УЗИ и лабораторной диагностики гинекологическим больным иногда нужна консультация других специалистов – уролога, маммолога, онколога.

ДНК- исследования- современные анализы на ИППП

При проведении ДНК-анализов возбудителя выявляют по фрагментам генетического материала:

• Для проведения анализа у женщин берётся соскоб с шейки матки, цервикального канала, заднего свода влагалища. Для этого используется цитощетка со съемной головкой. После взятия материала снимающаяся часть приспособления отсоединяется и помещается в раствор для последующего исследования
• У мужчин и женщин берется соскоб со слизистой мочеиспускательного канала с помощью цервикального зонда. У этого устройства также имеется съемная нижняя часть, которая после взятия материала отсоединяется и помещается в специальный раствор для отправки в лабораторию.

В лабораторных условиях полученный материал промывают, удаляя примеси, а из него выделяют генетический материал. Существует две разновидности такого исследования:

• Метод амплификации мишени, к которому относятся все разновидности ПЦР-диагностики. При проведении анализа полученный генетический материал многократно копируют – реплицируют, пока его не станет достаточно для проведения диагностики. Затем в пробу добавляют реактивы, которые при наличии в организме ДНК возбудителя реагируют с образованием соединений, обнаруживаемых лабораторным путем.
• Метод амплификации сигнала или гибридный захват. При таком методе во взятый материал добавляют реактивы, которые вступают в реакцию с ДНК возбудителя. В результате образуются вещества-гибриды. Затем полученные соединения обрабатывают химическими реактивами, заставляющими их светиться. Полученное свечение регистрируют с помощью прибора, многократно увеличивающего световой сигнал.

При проведении исследований используются вещества, реагирующие только на определенные микроорганизмы, поэтому ДНК-анализы не дают ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Существует три варианта такого анализа:

• Качественный, выявляющий только присутствие возбудителя. Считается положительным, если в мазке обнаружены антитела к микроорганизму, и отрицательным, если их там нет.
• Количественный, определяющий по концентрации антител количество патогенных микроорганизмов. Чем выше такой показатель, тем сильнее заражение.
• Типирование – определение разновидности конкретного возбудителя.

Существуют комбинированные методики, включающие качественный, количественный анализ и типирование, а также комплексные методы, обнаруживающие сразу несколько возбудителей ИППП. Чем больше данных выявит исследование, тем легче будет поставить диагноз.

ДНК-методика широко применяется для диагностики ИППП в Университетской клинике, поскольку редко даёт неправильные результаты, позволяет выявить большое количество микроорганизмов, включая вирусы и плохо выявляемые микробы, и оценить их концентрацию.

Контроль эффективности лечения ИППП

Анализы на половые инфекции нужно периодически сдавать даже при отсутствии симптомов и явных возможностей заражения. ИППП могут передаваться бытовым путем и протекать скрыто, поэтому заразившийся иногда не подозревает о наличии инфекции.

Анализы на ЗППП сдаются при получении справок для санаторно-курортного лечения и трудоустройства. Представители профессий, непосредственно работающих с людьми и продуктами питания, регулярно проходят такие исследования. Это необходимо, чтобы выявить скрытые инфекции, которые могут передаваться другим.

В Университетской клинике можно узнать, какие анализы на ИППП существуют, сдать их и получить достоверные результаты в максимально короткие сроки.

Сдать анализы на ИППП

Анализ ПЦР

Сущность метода состоит в том, что ДНК либо РНК взятого на исследование материала подвергается многократному преумножению (амплификации), что возможно при наличии ферментов. Благодаря этому получают большую массу ДНК либо РНК, по которой делают визуальную оценку. У специалистов имеется база сведений о строении всех болезнетворных возбудителей и в соответствии с ней дается оценка, какой микроорганизм получили.

Исследуемый материал (слюна, кровь, мокрота, др.) помещают внутрь специального прибора (амплификатор) и добавляют определенные ферменты. Они соединяются с исследуемыми ДНК либо РНК и вызывают синтез их копий. Посредством ПЦР возможно определить тип возбудителя, его количество.

Пробирки с исследуемым материалом

Плюсы и минусы

Методика ПЦР стала применяться в сфере медицины с недавнего времени и заняла важное место в диагностическом процессе. Преимущества метода:

Преимущества метода:

1. Прямое определение возбудителя. Некоторые методы, к примеру, иммуноферментный анализ, даёт возможность выявить выделяемые микробами белки. Это косвенное определение присутствия возбудителей. А посредством ПЦР с высокой точностью выявляется кусочек ДНК, принадлежащий определённой инфекции.
2. Специфичность методики. Поскольку ПЦР выявляет ДНК, принадлежащему возбудителю, получить ложное заключение практически невозможно (за исключением неизвестного возбудителя). А при иммунологическом методе может произойти ошибка вследствие перекрёстной реакции между антигенами.
3. Большая чувствительность. Метод определяет присутствие даже очень малого количества бактерий либо вирусов в организме. Достаточно 10 болезнетворных клеток на одну пробу. Для других методов минимальное количество клеток должно быть не менее 105.
4. Универсальность методики. Процесс исследования в отношении разных микроорганизмов схож из-за подобия всех ДНК, РНК. На основании этого в одной пробе возможно выявить несколько возбудителей.
5. Быстрое получение заключения. От момента забора пробы до получения результата проходит не более 4-5 часов. При ПЦР не нужен посев культуры, поэтому метод довольно быстрый.
6. Эффективность диагностирования при скрытых видах инфекций. Метод выявляет те микроорганизмы, которые трудно или вовсе не поддаются культивированию. Такие возбудители встречаются при скрытых формах заболевания.
7. Широкая сфера использования. ПЦР может быть использована не только в целях диагностики болезней человека, но и для определения микроорганизмах в почве, продуктах, воде и пр.

Но можно столкнуться и с недостатками ПЦР-метода:

1. Микробы способны изменяться. Возбудители могут меняться и мутировать. Поэтому они могут не поддаваться определению посредством ПЦР.
2. Возможность умножения ДНК не только живого, но одновременно и мёртвого возбудителя. Чтобы избежать такой ситуации, использовать ПЦР можно только через 1-2 месяца после восстановления от перенесённой ранее болезни.

В каких случаях нужно сдать анализы на ИППП

• Слизистые, гнойные, обильные пенистые, кровянистые выделения из половых путей и мочеиспускательного канала.
• Боль, резь, жжение, дискомфорт во влагалище и в области наружных половых органов.
• Очаги воспаления и трещины на слизистой интимной зоны.
• Высыпания и бородавчатые наросты на половых органах.
• Наличие язв во рту, в области заднего прохода, в паху, на половых органах, особенно в сочетании с увеличенными лимфоузлами.
• Мочеиспускание, сопровождающееся дискомфортом и выделением мочи с примесью крови и гноя.
• Боль при эрекции и половом акте.
• Выделение во время интимной близости семенной жидкости с примесью крови и гноя.
• Увеличение паховых лимфоузлов, их болезненность.
• Плохие результаты анализов – обнаружение в моче и мазках большого количества лейкоцитов, клеток эпителия, покрывающего поверхность интимных органов, примесей крови.
• Бесплодие – мужское и женское.
• Вялотекущий хронический уретрит и простатиты у мужчин, хронический воспалительный процесс половой сферы у женщин. Анализ нужно сдать, чтобы исключить ИППП, нередко сопровождающиеся такими проявлениями.
• Обнаружение ИППП у полового партнера.
• Планируемая беременность.
• Подготовка к операциям, гинекологическим, урологическим, хирургическим процедурам.
• Вероятное заражение – имевшийся незащищённый интимный контакт, нахождение в условиях вероятного бытового инфицирования.

КАК работает ПЦР

В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, с помощью ПЦР можно амплифицировать относительно короткие участки ДНК, длиной не более 3000 пар оснований. Используя смеси различных полимераз, специальных катализаторов и соблюдая особые условия, исследователям удавалось амплифицировать с помощью ПЦР фрагменты ДНК длиной 20-40 тыс. пар оснований. Но это все равно ничтожно мало в сравнении с длиной хромосомной ДНК эукариотической клетки. Геном человека, например, состоит примерно из 3 млрд. пар оснований.

Для того, что бы провести анализ методом ПЦР, необходимо иметь в наличии короткие одноцепочечные участки ДНК, специфичные для данного вида возбудителя, называемые «праймерами».

Но специфичного участка длиной в несколько тысяч оснований вполне достаточно, что бы дифференцировать тип возбудителя.

Для проведения ПЦР вначале исследуемый материал нагревают до температуры денатурации, добиваясь того, что бы двухцепочечные молекулы ДНК исходного материала разделились на одиночные нити. Затем вносят праймеры. При внесении праймеров в раствор с исследуемым материалом, праймеры начинают «прочесывать» раствор в поисках участков, к которым они являются комплиментарными. Если такие участки найдены – то праймеры присоединяются к ним, образовав стартовые двухниточные участки.

После присоединения праймера (этот процесс называют «отжиг») начинается синтез маркированного специфического участка ДНК с помощью специфического фермента – Taq-полимеразы, который получают из термофильных бактерий. Вновь синтезированные фрагменты ДНК становятся матрицами для синтеза новых участков ДНК в последующих циклах амплификации. Поэтому такая реакция и называется цепной. В результате 25 циклов амплификации из одного участка ДНК синтезируется 106 копий. А после 30-40 циклов нарабатывается достаточное количество ДНК, что бы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.

Диагностика методом ПЦР – выявление и диагностирование

Метод ПЦР – это такое исследование, которое выявляет фактически весь спектр возбудителей вирусного и бактериального характера. Полимеразная реакция, как диагностика заболеваний у мужчин, женщин и детей, показывает результаты исследований в различных областях медицины: гинекологии, урологии, терапии и так далее.

В частности, при сдаче крови идентифицируют такие заболевания:

• гепатиты вирусного характера: А, В, С и D, ТТ – сдается кровь;
• цитомегаловирус;
• ВИЧ;
• вирусы герпеса (обнаруживаются не только у мужчин и женщин, но и у детей соскоб показывает результат);
• опоясывающий лишай;
• инфекция энтеровирусная;
• токсоплазмоз;
• краснуху;
• коклюш;
• листериоз (сдается соскоб тканей лимфоузлов, кровь, околоплодные воды и т.д.) и прочее.

Стоит отметить, что цитомегаловирус является бессимптомным заболеванием. То есть человек со здоровой иммунной системой может носить в организме цитомегаловирус без знания проблемы заболевания. Цитомегаловирус наделен 60-тидневным инкубационным периодом. Запущенная форма болезни опасна для мужчин, при беременности, и порождает, как цепная реакция, энцефалит, пневмонию и прочие заболевания.

Методика ПЦР выявляет коклюш – острое инфекционное заболевание дыхательных путей (верхних), опасное так же при беременности, для детей и мужчин. Коклюш передается воздушно-капельным путем. Фактически 90% людей при контакте с больным, должны сдать анализ на коклюш, поскольку инфекция отличается повышенной контагиозностью.

При беременности коклюш может вызвать асфиксию плода. У мужчин, детей, женщин при беременности коклюш в запущенном виде поражает, как цепная реакция, сердечно сосудистую систему, легкие, бронхи. Чтобы обнаружить коклюш для исследования у мужчин, женщин и деток, берется соскоб либо мазок полости рта, кровь из вены/пальца, мокрота и моча.

Кроме крови ПЦР исследует иного рода биоматериалы: фрагменты мочи, соскоб, мазки, слюну у мужчин, детей, женщин и обязательно при беременности околоплодные воды по назначению врача, ведь стоимость исследования не мала. Частные лаборатории устанавливают собственную стоимость на производимые анализы.

Диагностика типового плана крайне важна, поэтому стоимость играет меньшую роль в определении заболевания. При получении ложноотрицательных результатов с лаборатории расшифровка их уже не важна, а болезнь может быть не идентифицирована и запущена цепная реакция инфецирования всего организма.